Tests d’écotoxicité aquatique

Système biologique exposé

• Lignée de cellules humaines U2OS

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Inhibition de l'expression de l'enzyme luciferase

Principe

• Le cytotox CALUX® consiste en une lignée cellulaire humaine d'ostéosarcome (U2OS) qui exprime de manière constitutive un niveau élevé de luciférase.
• En ajoutant le substrat approprié pour la luciférase, la lumière est émise.
• Si les cellules sont exposées à des composés cytotoxiques, la quantité de luciférase exprimée diminue. Ceci peut être mesuré par une diminution du signal lumineux.
• En tant que telle, la ligne est également utilisée comme contrôle générique dans les panels d'essai CALUX.

Durée

• Durée d’exposition: 24 h

Intérêt

• Le CALUX Cytotox indique si un échantillon est cytotoxique et à quelle concentration ou à quel facteur de dilution la cytotoxicité se produit.

Normes et références

• ECVAM method DB-ALM Protocol n° 197.: Automated CALUX reporter gene assay procedure.

Système biologique exposé

• Lignée cellulaire branchiale RTgill-W1 de truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• La viabilité cellulaire est évaluée à l'aide de trois colorants indicateurs fluorescents.

Principe du test

• L'essai sur la lignée cellulaire RTgill-W1 consiste en un test de toxicité aiguë sur plaque à 24 puits, basé sur la lignée cellulaire permanente de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss).
• Après 24 heures d'exposition à un produit chimique ou à un produit d'essai à six concentrations, la viabilité cellulaire est évaluée à l'aide de trois colorants indicateurs fluorescents.
• Les données sont exprimées en pourcentage de viabilité cellulaire des témoins non exposés en fonction de la concentration du produit chimique testé.
• Les courbes concentration-réponse qui en résultent servent à déterminer les concentrations efficaces entraînant une perte de 50 % de la viabilité cellulaire (valeurs EC50). La valeur EC50 la plus basse observée est utilisée comme approximation pour prédire la toxicité aiguë pour le poisson (valeur LC50).

Durée

• Durée d'exposition : 24 h

Intérêt 

• Outre le fait qu'il s'agit d'une alternative sans animaux au test traditionnel très sévère sur les poissons (par exemple, selon le document TG203 de l'OCDE), l'essai sur la lignée cellulaire branchiale nécessite environ trois ordres de grandeur de matériel d'essai en moins, ce qui en fait le choix idéal pour le criblage, par exemple dans le cadre de la synthèse de nouveaux produits chimiques et de la mise au point de produits.

Normes et références

• OECD (2021), Test No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity - The RTgill-W1 cell line assay, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2, OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/c66d5190-en.

Système biologique exposé

• Lignée de cellules humaines U2OS

Effets ou modes d’action mis en évidence

• L'expression du gène de la luciférase montre l'activation de la voie Nrf2 qui est activée par le stress oxydatif et les antioxydants.

Principe du test

• Le CALUX® sensible au Nrf2 (Nrf2) est composé d'une lignée cellulaire humaine (U2OS)
  contenant le gène de la luciférase de la luciole sous le contrôle de quatre éléments réactifs
  aux électrophiles (EpRE).
• La luciférase sert de gène rapporteur pour l'activation de la voie Nrf2. Cette voie est activée par le stress oxydatif et les antioxydants. L'activation de la voie entraîne l'expression de la luciférase et l'ajout du substrat approprié pour la luciférase permet de détecter cette dernière sous forme de lumière.
• La quantité de lumière produite est proportionnelle à la concentration des composés activant la voie Nrf2.
• L'activation de la voie provoquée par l'échantillon est comparée à l'activation provoquée par le contrôle positif, la curcumine. Les bioessais Nrf2 CALUX rapportent les équivalents totaux de curcumine.

Durée

• Durée d'exposition : 24 h

Intérêt 

• De nombreux polluants entraînent un stress oxydatif par la formation accrue de radicaux libres.

Normes et références

• Van der Linden, SC, von Bergh A, Van Vugt-Lussenburg B, Jonker L, Brouwer A, Teunis M, Krul C and Van der Burg B. (2014) Development of a panel of high throughput reporter gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress, Mutation Res.760,23-32

Système biologique exposé

• Lignée cellulaire de rat (H4IIE)

Effets ou modes d'action mis en evidènce

• Le test indique la présence de dioxines (PCDD), de composés de type dioxine (par exemple les furanes (PCDF) et les PCB de type dioxine (dl-PCB)) par le biais de leur liaison au récepteur des hydrocarbures aryliques (AhR).

Principe du test

• Dans la lignée cellulaire, le gène de la luciférase de la luciole est couplé en tant que gène rapporteur à des éléments réactifs aux dioxines (DRE) qui indiquent la présence de dioxines (PCDD), de composés de type dioxine (par exemple, les furanes (PCDF) et les PCB de type dioxine (dl-PCB).
• Après la liaison des dioxines et/ou des composés de type dioxine au récepteur cytosolique des hydrocarbures aryliques (AhR), le complexe ligand-récepteur se lie au DRE.
• Les cellules exposées aux dioxines ou aux composés de type dioxine expriment non seulement des protéines associées à la DRE dans des conditions normales, mais aussi la luciférase. En ajoutant le substrat correspondant à la luciférase, de la lumière est émise.
• La quantité de lumière générée est proportionnelle à la quantité de liaison au récepteur spécifique au ligand, qui est comparée aux composés de référence correspondants (2, 3, 7, 8-TCDD). Les bioessais DR CALUX fournissent des TEQ totaux de 2,3,7,8-TCDD pour les échantillons environnementaux et des TEQ totaux pour les échantillons de denrées alimentaires/d'aliments pour animaux.

Durée

• Durée d'exposition 24 h

Intérêt 

• Le DR CALUX indique si un échantillon contient des dioxines ou des composés de type dioxine.

Normes et références

• Van Vugt-Lussenburg, B., Van der Burg, B., Besselink, H.,  Brouwer, A. (2013) DR CALUX^®, A high-throughput screening assay for the detection of dioxin and dioxin-like compounds in food and feed. In “High throughput screening methods in toxicity testing” (P. Steinberg, ed). John Wiley and Sons, Inc. New York. ISBN 9781118065631. Pp 553-546.

Système biologique exposé

• Lignée cellulaire humaine U2OS

Effets ou modes d'action mis en evidènce

• Le test détecte la présence de différents polluants par leur liaison au récepteur Pregnane X.

Principe du test

• Le récepteur Pregnan-X PXR est un récepteur nucléaire dont la fonction principale est de détecter les substances toxiques étrangères à l'organisme et d'activer l'expression des protéines responsables de la détoxication et de l'excrétion.
• Dans la lignée cellulaire, le gène de la luciférase de la luciole est couplé au PXR en tant que gène rapporteur afin d'indiquer la présence de substances toxiques.
• Après la liaison des substances au PXR, le gène correspondant est lu et le gène rapporteur est lu à son tour. Ce gène code pour une enzyme (luciférase) qui transforme la luciférine en produisant de la lumière.
• La quantité de lumière générée est proportionnelle à la quantité de liaison au récepteur spécifique au ligand, qui est comparée aux composés de référence correspondants (nicardipine). La concentration est exprimée en équivalents toxiques (TEQ) ou en équivalents bioanalytiques (BEQ).

Durée

• Durée d'exposition 24 h

Intérêt 

• Le DR CALUX indique si un échantillon contient des dioxines ou des composés de type dioxine.

Normes et références

• Piersma AH, Schulpen SHW, Uibel F, Van Vugt-Lussenburg, B, Bosgra S, Hermsen SAB,
  Roelofs MJE, Man, H., Jonker, L., Van der Linden, S, Van Duursen MBM, Wolterbeek APM, ,
  Schwarz M, Kroese ED, Van der Burg B. (2013) Evaluation of an alternative in vitro test
  battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38,53-64

Système biologique exposé

• Lignée cellulaire de rat (H4IIE)

Effets ou modes d'action mis en evidènce

• Le test indique la présence d'hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) par leur liaison au récepteur des hydrocarbures aryliques (AhR).

Principe du test

• Dans la lignée cellulaire, le gène de la luciférase de luciole est couplé en tant que gène rapporteur à des éléments réactifs à la dioxine (DRE), qui indiquent également la présence d'hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP). Grâce à la méthode de préparation spécifique et à la courte durée d'incubation, ceux-ci ne lient typiquement ici que les HAP.
• Après la liaison des HAP au récepteur cytosolique des hydrocarbures aryliques (AhR), le complexe ligand-récepteur se lie au DRE.
• Les cellules exposées à l'HAP expriment non seulement des protéines associées à la DRE dans des conditions normales, mais aussi la luciférase. En ajoutant le substrat correspondant à la luciférase, de la lumière est émise.
• La quantité de lumière produite est proportionnelle à la quantité de liaison au récepteur spécifique au ligand, qui est comparée au composé de référence correspondant (benzopyrène). La concentration est exprimée en équivalents toxiques (TEQ) ou en équivalents bioanalytiques (BEQ).

Durée

• Durée d'exposition 6 h

Intérêt 

• Le PAH CALUX indique la présence de nombreux hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP).

Normes et références

• Pieterse B, Felzel E, Winter R, van der Burg B, Brouwer A (2013) PAH-CALUX, an
  optimized bioassay for carcinogenic hazard identification of polycyclic aromatic
  hydrocarbons (PAHs) as individual compounds and in complex mixtures. Environ Sci
  Technol, 47, 11651-11659.

Système biologique exposé

• Lignée cellulaire humaine 

Effets ou modes d'action mis en evidènce

• Le transport de l'hormone thyroïdienne thyroxine (T4) par la protéine de transport transthyrétine (TTR) est perturbé par des composés alkylés per- et polyfluorés (PFAS).

Principe du test

• Les PFAS perturbent le transport du ligand naturel thyroxine (T4) par la protéine de transport transthyrétine (TTR). Le PFAS CALUX® utilise cela pour mesurer les composés PFAS indépendamment de leur structure.
• Le PFAS CALUX consiste en un test de liaison TTR combiné au biotest TRbeta CALUX. La perturbation de la liaison TTR par le T4 est comparée à l'acide perfluorooctanoïque (PFOA) comme composé de référence et exprimée en équivalents PFOA/g d'échantillon traité.
• La préparation et la purification de l'échantillon ne sont pas compliquées et permettent une application réussie à une large gamme de matrices.

Durée

• 42 h

Intérêt 

• Le PFAS CALUX révèle la présence de nombreux composés alkylés perfluorés et polyfluorés (PFAS).

Normes et références

• Behnisch P, Besselink H, Weber R, Willand W, Huang J, Brouwer A. (2021) Developing
  potency factors for thyroid hormone disruption by PFASs using TTR-TRβ CALUX®
  bioassay and assessment of PFASs mixtures in technical products. Environment
  International 157, 106791

Système biologique exposé

• Levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Activation ou inhibition du récepteur humain des œstrogènes (test YES, effets œstrogéniques ou anti œstrogéniques)
• Activation ou inhibition du récepteur humain des androgènes (test YAS, effets androgéniques ou anti androgéniques)

Principe (exposé dans le cas du test YES)

• Visualisation des effets œstrogéniques grâce au couplage du gène du récepteur humain des œstrogènes avec un gène rapporteur (LacZ) dans des cellules de levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae) génétiquement modifiées.
• La fixation d’une substance à effet œstrogénique au récepteur des œstrogènes provoque la traduction/transcription du gène correspondant et donc du gène rapporteur qui lui est associé. Ce dernier code pour une enzyme, la β-galactosidase, qui catalyse une réaction colorimétrique (passage du jaune au rouge) pouvant donc être directement mise en relation avec la présence de substances à activité œstrogénique. heures
• Au bout de 18 heures d’exposition, l’induction de la réaction colorée permet de juger de l’œstrogénicité de la substance ou de l’échantillon étudié(e).
• La digestion des cellules de levure avec la lyticase (L-YES) après l'exposition permet d'augmenter la sensibilité d'environ un ordre de grandeur.
• Le même principe peut être utilisé pour mettre en évidence la présence de substances provoquant des effets anti œstrogéniques par le test YES ou des effets androgéniques ou anti androgéniques par le test YAS.

Diagramme

• Download diagramme YES
• Download diagramme L-YES

Vidéo tutorielle

Durée de l’essai

• 3 jours (durée d’exposition: 18 heures)

Intérêt

• Convient à la détection de nombreuses substances naturelles ou artificielles agissant sur le système hormonal comme certains perturbateurs endocriniens issus des produits de consommation courante comme la pilule contraceptive (17α-éthinylestradiol), les plastiques (bisphénol A, phtalates), les pesticides (méthoxychlore) ou les détergents (alkylphénols des surfactants non ioniques).
• Les substances interférant avec le système endocrinien en activant ou en inhibant les récepteurs des œstrogènes ou des androgènes peuvent par exemple perturber les fonctions reproductrices, affecter le métabolisme et le système immunitaire et provoquer le développement de tumeurs cancéreuses.

Normes et références

• ISO 19040-1:2018 Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water — Part 1: Yeast estrogen screen (Saccharomyces cerevisiae)
• Routledge EJ and Sumpter JP (1996). Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ. Toxicol. Chem. 15(3): 241-248.

Système biologique exposé

• Lignée de cellules humaines U2OS-ERα ou bien U2OS-AR

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Activation ou inhibition du récepteur humain α des œstrogènes (effets œstrogéniques)
• Activation ou inhibition du récepteur humain des androgènes (effets androgéniques)

Principe

• Ce test fait appel à une lignée cellulaire humaine dans laquelle le gène du récepteur des œstrogènes/androgènes a été couplé à un gène dit rapporteur codant pour la luciférase.
• La fixation de substances œstrogéniques/androgénique au récepteur des œstrogènes/androgènes provoque la traduction/transcription concomitante du gène correspondant et du gène rapporteur associé codant pour une enzyme, la luciférase, qui catalyse une réaction luminescente d’oxydation de la luciférine.
  L’émission de lumière est proportionnelle à la quantité de substance se liant au récepteur.
• Les mesures de luminescence sont effectuées au bout de 24 heures d’exposition aux substances ou échantillons à tester.
• Selon le même principe, les substances anti-œstrogénique sont detectés dans le test anti-ER-Calux® et les substances anti-androgènique dans le test AR-Calux®.

Durée

• 3 j (durée d’exposition: 24 h)

Intérêt

• Convient à la détection de nombreux toxiques issus de produits de consommation courante comme la pilule contraceptive (17α-éthinylestradiol), les plastiques (bisphénol A, phtalates), les pesticides (alachlor, méthoxychlore) ou les détergents (alkylphénols des surfactants non ioniques)
• Généralement plus sensible que les tests YES et YAS

Normes et références

• ISO 19040-1:2018 Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water — Part 3: In vitro human cell-based reporter gene assay
• Van Der Linden SC, Heringa MB, Man HY, Sonneveld E, Puijker LM, Brouwer A, Van Der Burg B (2008). Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents and surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42: 5814-5820.

Système biologique exposé

• Salmonelles (Salmonella typhimurium)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Altérations héréditaires du patrimoine génétique (effets mutagènes)

Durée

• 3 j (durée d’exposition: 48 h)

Principe

• Le test fait appel à un mutant de Salmonella typhimurium (mutant His) devenu incapable de synthétiser l’histidine et donc inapte à se développer sur milieu de culture privé de cet acide aminé.
• Au contact de substances mutagènes, les bactéries mutantes peuvent subir des mutations réverses qui leur restituent leur capacité à synthétiser l’histidine.
  Ces mutants réverses sont à nouveau capables de se développer sur milieu sans histidine.
• Plus le taux de colonies de mutants réverses est important parmi les bactéries exposées, plus le potentiel mutagène des substances testées est élevé.

Intérêt

• Permet la détection rapide d’un potentiel mutagène chez les substances ou mélanges testés (rapidité de multiplication des bactéries donc rapidité d’obtention de mutations)
• Facilité de détection des quelques mutants parmi la multitude de cellules restées intactes.

Mais:

• Méthode in vitro: Le comportement des substances dans les organismes complexes comme ceux des mammifères ne peut être simulé avec exactitude (simulation partiellement possible par apport de S9 Mix, un extrait de foie renfermant des enzymes du métabolisme à imiter)
• Un effet mutagène sur les bactéries n’implique pas nécessairement d’effet mutagène sur les mammifères
• Différence de complexité entre les bactéries et les cellules de mammifères (ces dernières disposent de systèmes capables de détecter les anomalies dans l’ADN et de détruire ou d’empêcher la multiplication des cellules touchées ; les bactéries sont des organismes unicellulaires)

Normes et références

• Norme DIN: Deutsches Institut für Normung (1999). Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung - Suborganismische Testverfahren (Gruppe T) - Teil 4: Bestimmung des erbgutverändernden Potentials mit dem Salmonella-Mikrosomen-Test (Ames Test) (T 4). DIN 38415-4.
• Norme ISO: International Organization for Standardization (2005). Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water -- Salmonella/microsome test (Ames test). ISO 16240, 20 p.

Système biologique exposé

• Salmonelles (Salmonella typhimurium)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Activation du système SOS de réparation de l’ADN dans les cellules (génotoxicité)

Principe

• L’UmuC-test fait appel à une souche génétiquement modifiée de la bactérie Salmonella typhimurium.
• Les substances génotoxiques provoquent dans les cellules bactériennes l’induction du gène de la protéine UmuC qui intervient dans le mécanisme de réparation SOS mis en place pour préserver l’intégrité de l’ADN. Dans la souche bactérienne utilisée, ce gène a été couplé à un gène rapporteur codant pour la β-galactosidase, une enzyme qui catalyse la transformation d’un composé coloré et produit donc une réaction colorimétrique utilisable pour détecter la présence de substances génotoxiques.

Durée

• 1,5 j (durée d’exposition: 2 h)

Intérêt

• Mise en évidence de dommages causés à l’ADN (génotoxicité)
• La génotoxicité se définit par la capacité de certaines substances, dites génotoxiques, à induire des dommages dans l’appareil génétique ou génome. Au niveau cellulaire, ces substances génotoxiques peuvent provoquer des cassures chromosomiques, des insertions ou pertes de bases et donc des anomalies de lecture de l’ADN. Dans la plupart des cas, ces lésions sont détectées et réparées par le système SOS de la cellule. La présence de ces dommages à l’ADN peut alors être détectée par l’UmuC-test.
• Lorsque les altérations de l’ADN ne peuvent pas être réparées, elles sont transmises aux cellules-filles et à leur descendance. Ces effets, conséquence héréditaire et irréparable de la génotoxicité, sont qualifiés de « mutagènes ». C’est le test d’Ames qui permet de les mettre en évidence.

Normes et références

• Norme ISO: International Standard Organisation (1996/2000) Water quality - Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu-test, EN ISO 13829 (2000) and 38415-3 (1996).
• Escher BI, Bramaz N, Quayle P, Rutishauser S (2008). Monitoring of the ecotoxicological hazard potential by polar organic micropollutants in sewage treatment plants and surface waters using a mode-of-action based test battery, J. Environ. Monit. 10, 622-631.

Système biologique exposé

• L’enzyme acétylcholine estérase (d’anguille par exemple)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Inhibition de l’enzyme acétylcholine estérase (effets neurotoxiques dus aux organophosphorés ou aux carbamates = insecticides)

Principe

• L’inhibition de l’acétylcholine estérase par un toxique induit l’accumulation d’acétylcholine dans l’organisme, un neurotransmetteur dont la non-élimination induit une stimulation continue et dommageable des muscles et cellules nerveuses.
• La présence ou l’absence d’inhibition de l’enzyme est observée après exposition à la substance ou à l’échantillon à étudier.
• L’inhibition peut être mesurée aussi bien dans l’organisme entier que sur des enzymes isolées.

Durée

• 1 jour (durée d’exposition: 10 min)

Intérêt

• Se prête par exemple à la détection de pesticides fonctionnant spécifiquement par inhibition de l’acétylcholine estérase (organophosphorés, carbamates).

Normes et références

• Norme DIN : Deutsches Institut für Normung (1995). Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung - Suborganismische Testverfahren (Gruppe T) - Teil 1 : Bestimmung von Cholinesterase-hemmenden Organophosphat und Carbamat-Pestiziden (Cholinesterase-Hemmtest) (T 1). DIN 38415-1.
• Ellman GL, Courtney KD, Andres jr V, Featherstone RM (1961). A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7: 88-90.
• Hamers T, Molin KRJ, Koeman JH, Murk AJ (2000). A small-volume bioassay for quantification of the esterase inhibiting potency of mixtures of organophosphate and carbamate insecticides in rainwater: Development and optimization. Toxicol. Sci. 58:60-67.

Organisme de test

• Algue verte unicellulaire d’eau douce (Raphidocelis subcapitata)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Inhibition da la photosynthèse (action herbicide)
• Inhibition de la croissance

Principe

• Les effets spécifiques sur la photosynthèse algale dus à une action herbicide sont mesurés au bout de 2 et 24 heures d’exposition à la substance ou à l’échantillon à tester tandis que l’inhibition, non spécifique, de croissance est évaluée en fin d’exposition.
• Le test combine une observation des effets sur la croissance avec une mesure de l’inhibition de la photosynthèse.
• Une inhibition de croissance révèle une toxicité non spécifique de l’échantillon et se mesure par la densité de cellules quantifiée par l’absorption à 685 nm.
• L’inhibition de la photosynthèse résulte d’une inhibition du photosystème II révélatrice de l’action toxique spécifique de substances aux propriétés herbicides.

Exécution du test

• Download diagramme test algues combiné
• SOP à commender gratuitement chez Andrea Schiffeli

Vidéo tutorielle

Durée

• 24 h

Intérêt

• Organisme représentatif des producteurs primaires
• Algue utilisée dans de nombreux tests standardisés d’évaluation de la qualité de l’eau (normes OCDE, ISO, US EPA)

Normes et références

• Escher BI, Bramaz N, Mueller JF, Quayle P, Rutishauser S (2008). Toxic equivalent concentrations (TEQs) for baseline toxicity and specific modes of action as a tool to improve evaluation of ecotoxicity tests on environmental samples J. Environ. Monit. 10, 612-621.
• Escher BI, Rutishauser S (2007). The combined algae test- a new routine 96-well-plate biotest for simultaneously assessing the photosynthesis inhibition and effect on growth in green algae. Internal Report, Eawag, Dübendorf, Switzerland
• International Organization for Standardization (2004). Water quality -- Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae. ISO 8692: 15 p.
• Schreiber U, Quayle P, Schmidt S, Escher BI, Mueller J (2007). Methodology and evaluation of a highly sensitive algae toxicity test based on multiwell chlorophyll fluorescence imaging. Biosens. Bioelectron. 22, 2554-2563.

Système biologique exposé

• Différents micro-organismes (bactéries, levures, voir les informations sur le test d'œstrogénicité sur levures, le test umuC, le test bioluminescence batérienne)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Différents points finaux peuvent être combinés avec la chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC). Le Centre Ecotox évalue en routine l'inhibition de la luminescence bactérienne (test de bioluminescence bactérienne), l'activation du récepteur des œstrogènes (test d’œstrogénicité sur levures) et l'activation des voies de réparation de l'ADN (test umuC).
• Les effets de plusieurs substances chimiques séparées les unes des autres peuvent être détectés simultanément, ce qui permet d'établir un lien avec des substances chimiques individuelles ou de dresser un profil de la bioactivité.

Principe

• Les produits chimiques contenus dans un échantillon sont d'abord séparés par chromatographie sur une plaque HPTLC.
• Des micro-organismes d'un système de test souhaité sont appliqués sur la plaque contenant les produits chimiques séparés.
• Le substrat qui provoque un changement de couleur ou une luminescence dans le biotest est pulvérisé sur la plaque.
• Les organismes testés réagissent aux produits chimiques présents dans l'échantillon en présentant une luminescence plus faible ou un changement de couleur, indiquant ainsi la position des produits chimiques sur la plaque HPTLC.
• Le comportement chromatographique des produits chimiques peut être comparé entre les différents échantillons et avec des produits chimiques standard.
• Les bandes bioactives sont extraites de la plaque et utilisées pour d'autres analyses biologiques ou chimiques. Par exemple, l'identité des substances bioactives peut être élucidée par spectrométrie de masse à haute résolution (LC-HRMS/MS).

Durée

• 1-3 d (durée d'exposition : 0,5 - 3 h)

Intérêt

• Peut détecter simultanément plusieurs produits chimiques séparés les uns des autres.
• Peut réduire les effets de matrice sur l'effet spécifique du test (par exemple, masquer la cytotoxicité).
• Les tests HPTLC sont généralement plus sensibles que les tests microtitres correspondants.

Normes et références

• Bergmann, A. J., Simon, E., Schifferli, A., Schönborn, A., & Vermeirssen, E. L. M. (2020). Estrogenic activity of food contact materials - evaluation of 20 chemicals using a yeast estrogen screen on HPTLC or 96-well plates. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 412, 4527-4536. doi.org/10.1007/s00216-020-02701-w 
• Bergmann, A. J., Breitenbach, M., Muñoz, C., Simon, E., McCombie, G., Biedermann, M., Schönborn, A., Vermeirssen, E. L. M. (2023). Towards detecting genotoxic chemicals in food packaging at thresholds of toxicological concern using bioassays with high-performance thin-layer chromatography. Food Packaging and Shelf Life, 36, 101052 (11 pp.). doi.org/10.1016/j.fpsl.2023.101052 
• Bergmann, A. J., Masset, T., Breider, F., Dudefoi, W., Schirmer, K., Ferrari, B. J. D., & Vermeirssen, E. L. M. (2024). Estrogenic, genotoxic, and antibacterial effects of chemicals from cryogenically milled tire tread. Environmental Toxicology and Chemistry. doi.org/10.1002/etc.5934 

Système biologique exposé

• Bactérie luminescente marine (Vibrio fischeri)

Effets ou modes d’action mis en évidence

• Inhibition de la bioluminescence (toxicité non spécifique)

Principe

• Le test est basé sur l’inhibition de la luciférase, une enzyme qui catalyse l’oxydation de la luciférine qui s’accompagne d’une émission de lumière. Un résultat positif indique la présence de substances agissant sur le métabolisme énergétique des cellules.
• Les effets des substances ou échantillons testés sur la bioluminescence bactérienne sont mesurés au bout de 30 minutes d’exposition.

Diagramme

• Download diagramme test de bioluminiscence bactérienne

Durée

• Environ une demi-journée (durée d’exposition: 30 min)

Intérêt

• Bon screening pour évaluer la toxicité d’échantillons de composition inconnue
• Bactérie utilisée dans de nombreux tests standardisés d’évaluation de la qualité de l’eau (normes OCDE, ISO, US EPA)
• Test fréquemment utilisé pour l’étude des eaux usées et effluents d’épuration, imposé dans certains pays (ordonnance allemande sur les rejets d’eaux usées par exemple)

Normes et références

• Norme ISO: International Organization for Standardization (2007). Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 3: Method using freeze-dried bacteria. EN ISO 11348-3.
• Escher BI, Bramaz N, Mueller JF, Quayle P, Rutishauser S, Vermeirssen ELM (2008). Toxic equivalent concentrations (TEQs) for baseline toxicity and specific modes of action as a tool to improve interpretation of ecotoxicity testing of environmental samples. J. Environ. Monit. 10, 612-621

Organisme exposé

• Gammarus fossarum

Effets détectables

• Réduction ou stimulation de la prise de nourriture chez les gammares

Principe

• Des gammares sont placés isolément dans des cages maintenues dans le cours d’eau en amont et en aval d’une source ponctuelle de pollution. Des feuilles pré-conditionnées sont mises à leur disposition pour leur alimentation.
• Les cages sont retirées au bout d’une semaine et les gammares et feuilles restantes séchés.
• Le taux d’alimentation est ensuite déterminé à partir du poids sec des microcrustacés et des feuilles avant et après exposition.

Durée du test

• Au moins 7 jours

Intérêt

• Les gammaridés sont des organismes détritivores qui se nourrissent de matière organique grossière et, dans une moindre mesure, d’algues et autres petits animaux (MacNeil et al. 1997). Ils jouent un rôle déterminant pour la dégradation des litières dans les cours d’eau et contribuent fortement à l’alimentation des poissons (Andersen et al. 1993).
• La baisse de prise de nourriture est une réaction non spécifique au stress qui, chez Gammarus fossarum, peut être causée par de nombreux facteurs (Maltby et al. 2002).
• La baisse du taux d’alimentation peut affecter le développement, la croissance et la reproduction (Naylor et al. 1989). Elle peut se répercuter sur les performances de la communauté et le fonctionnement de l’écosystème (dégradation des matières détritiques et litières).
• Le comportement alimentaire des gammares peut être influencé par des facteurs intrinsèques et extrinsèques: maladies parasitaires, origine de la population, taille des individus etc. (intrinsèques) ; température, oxygène dissous, pH etc. (extrinsèques).
• Pour pouvoir évaluer l’impact des rejets de stations d’épuration, ces paramètres doivent être connus avec précision. En général, la similitude des conditions physico-chimiques en amont et en aval des points de rejet permet assez facilement d’établir des comparaisons.
• Dans plusieurs études, une réduction du taux d’alimentation des gammares a été observée en aval des stations d’épuration (Bundschuh et al. 2011).

Organisme de test

• Grande daphnie (Daphnia magna)

Principe

• Mesure des effets des substances ou échantillons à tester sur la mobilité des daphnies après 24 ou 48 h d’exposition.

Paramètre étudié

• Inhibition de la mobilité (= mortalité)

Durée

• 24 ou 48 h

Intérêt

• Organismes zooplanctoniques des eaux stagnantes se nourrissant d’algues, les daphnies constituent l’élément de base de l’alimentation des poissons.
• Modèle biologique standard pour l’étude de l’écotoxicité aiguë des substances chimiques et échantillons d’eau

Normes et références

• OCDE (2004). Ligne directrice de l’OCDE pour les essais de produits chimiques 202: Daphnia sp., Essai d’immobilisation immédiate.

Organisme de test

• Ceriodaphnia dubia
• Grande daphnie (Daphnia magna)

Principe

• Les polluants peuvent affecter la capacité des daphnies à assurer leur descendance.
• Les effets des contaminants chimiques sur la reproduction des daphnies sont étudiés dans un test de toxicité chronique réalisé sur 7/8 ou 21 jours.
• Dans ce test, des daphnies adultes sont maintenues dans un milieu expérimentalement contaminé ou un échantillon environnemental pendant une durée déterminée au bout de laquelle leurs descendants sont dénombrés.
• La comparaison du nombre de descendants de daphnies témoins et de daphnies exposées permet d’observer aussi bien les accroissements que les baisses du taux de reproduction.

Paramètres et effets étudiés

• Effets sur la croissance de la population/ le nombre de descendants (reprotoxicité)
• Mortalité des adultes géniteurs

Durée

• 7 ou 8 jours (C. dubia)
• 21 jours (D. magna)

Intérêt

• Organismes zooplanctoniques des eaux stagnantes se nourrissant d’algues, les daphnies constituent l’élément de base de l’alimentation des poissons
• Modèle biologique standard pour l’étude de l’écotoxicité chronique des substances chimiques et échantillons d’eau

Normes et références

• Norme ISO: International Organization for Standardization (2008) Water quality -- Determination of chronic toxicity to Ceriodaphnia dubia. ISO 20665:2008. 21 p.
• Norme AFNOR: Association Française de Normalisation (2000). AFNOR NF T 90-376, Water quality—determination of chronic toxicity to Ceriodaphnia dubia in 7 days. Population growth inhibition test.
• Norme OCDE: OCDE (2004). Ligne directrice de l’OCDE pour les essais de produits chimiques 211: Daphnia magna, essai de reproduction.

Système biologique exposé

• Embryons de poisson-zèbre (Danio rerio) âgés de 0 à 5 jours.

Effets ou modes d'action mis en évidence

• La mortalité des embryons est évaluée.

Principe

• Des œufs de poisson zèbre fraîchement fécondés sont exposés au produit chimique testé pendant 96 heures.
• Toutes les 24 heures, quatre paramètres sont enregistrés comme indicateurs de mortalité : la coagulation des œufs fécondés, l'absence de formation de somites, l'absence de séparation de la queue du sac vitellin et l'absence de battement cardiaque.
• À la fin de la période d'exposition, la toxicité aiguë est établie sur la base d'au moins un des quatre paramètres de mortalité et la CL50 est calculée.

Durée

• Temps d'exposition 96 h

Intérêt

• L'utilisation d'embryons de poissons zèbres (Danio rerio) pour prédire la toxicité aiguë des poissons est une alternative précieuse et de plus en plus acceptée aux tests sur animaux avec des poissons jeunes et adultes. De nombreuses études ont demontré une excellente comparabilité entre les données de toxicité de l'embryon de poisson zèbre et la toxicité aiguë chez le poisson (OCDE 203).

Littérature

• OECD (2013), Essai n° 236 : Poisson, essai de toxicité aiguë au stade embryonnaire, Lignes directrices de l'OCDE pour les essais de produits chimiques, Section 2, OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264203716-fr.