Œstrogènes dans le milieu aquatique – screening et évaluation du risque pour les besoins européens

Dans le cadre d'un projet européen, la contamination d'échantillons d'eau par les œstrogènes a été étudiée à l'aide de méthodes biologiques et chimiques. L'étude a montré que les biotests basés sur les cultures cellulaires se prêtaient particulièrement bien à la détection des substances devant faire l'objet d'une surveillance à l'échelle européenne.

Les perturbateurs endocriniens peuvent provoquer une féminisation des poissons, dérégler leur système immunitaire et affecter d'autres organismes aquatiques sensibles. Ces faits ont été démontrés dans de nombreuses études scientifiques. Les œstrogènes stéroïdes tels que le 17β-estradiol (E2), le 17α-éthinylestradiol (EE2) et le métabolite estrone (E1) sont particulièrement actifs. Alors que l'E1 et l'E2 sont naturellement produits chez les humains et les animaux , l'EE2 est une hormone de synthèse utilisée dans les méthodes de contraception orale. Étant donné que ces composés se déversent en continu dans les eaux usées puis dans le milieu aquatique et que l'E2 et l'EE2 présentent une forte activité biologique, ils peuvent affecter des populations entières à des concentrations extrêmement faibles. Face à ce constat, l'UE a inscrit ces trois substances sur la liste européenne de vigilance pour les substances potentiellement dangereuses pour l'eau. Les concentrations des composés de cette liste doivent être régulièrement mesurées afin de générer des données permettant de déterminer le risque qu'ils représentent pour l'environnement aquatique et, le cas échéant, de les réglementer.

Le problème des seuils de détection

L'analyse chimique des substances se heurte encore souvent à des problèmes de sensibilité des techniques. En effet, les limites de détection doivent être au moins du niveau des valeurs limites écotoxicologiques proposées pour les expositions chroniques (normes de qualité environnementale, NQE) et dont le dépassement indique l'existence d'un risque d'effets néfastes sur les organismes : dans l'UE, les NQE proposées sont de 3600 pg/l pour l'E1, de 400 pg/l pour l'E2 et de 35 pg/l pour d'EE2.

« Les méthodes biologiques permettent de détecter les composés à des concentrations extrêmement faibles, indique Robert Kase du Centre Ecotox qui coordonne le projet. Elles pourraient donc être employées pour les screenings et venir compléter les analyses chimiques dans les programmes de surveillance. » Par ailleurs, les biotests présentent l'avantage de ne pas exiger de connaissances préalables sur les polluants présents dans l'échantillon étudié et de mesurer la réponse biologique aux mélanges de substances ayant le même mode d'action, qu'elles soient connues ou inconnues.

Les biotests utilisés pour détecter les œstrogènes sont en général des tests sur lignées cellulaires dans lesquels la fixation des substances sur le récepteur humain des œstrogènes est visualisée grâce à un gène rapporteur. Les cellules employées peuvent être des cellules de levure, des cellules humaines ou des cellules d'autres mammifères. « Ces systèmes sont très performants pour la détermination des concentrations infimes d'œstrogènes dans les eaux de surface, explique Robert Kase. Les autorités européennes hésitent cependant encore à les recommander pour les programmes de surveillance de la DCE en raison, notamment, d'un manque de données systématiques prouvant leur applicabilité pour les screenings et le monitoring. »

Collaboration et échantillonnage à l'échelle européenne

Face à cette situation, le Centre Ecotox s'est associé à l'Istituto Superiore di Sanità (IT) et à la Commission européenne pour coordonner un projet international visant à évaluer la qualité des biotests sur lignées cellulaires pour la mise en évidence de l'EE2, de l'E2 et de l'E1 dans les cours d'eau et les effluents. Dans ce projet, des équipes de Suisse, d'Allemagne, d'Italie, de France, de Tchéquie et des Pays-Bas ont comparé les analyses chimiques et biologiques de 16 échantillons d'eau de rivière et de 17 échantillons d'eaux usées prélevés dans toute l'Europe. Trois laboratoires ont analysé les échantillons par chromatographie liquide haute résolution couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) avec ionisation par électronébulisation (electrospray ionisation ESI). Cinq laboratoires ont effectué des tests de liaison aux récepteurs avec lignées cellulaires pour détecter les composés œstrogéniques, à savoir l'ER-CALUX et l'ER-GeneBLAzer commerciaux et les tests non commerciaux MELN, HeLa-9903 et pYES. Le test de pYES fait appel à des cellules de levure, les autres à des cultures de cellules humaines.

« Les analyses chimiques n'ont permis de mesurer les concentrations d'E2 et d'EE2 que dans une partie des échantillons, rapporte Robert Kase. Les limites de détection étaient souvent trop élevées. » Ainsi, l'E2 n'a pu être détecté dans les concentrations voulues que dans 4 % des échantillons d'eau de rivière. Pour l'EE2, cette proportion atteignait 44 %. Les problèmes de détection étaient encore plus prononcés dans les échantillons d'effluents étant donné que les eaux usées contiennent davantage de polluants susceptibles de perturber les analyses. Les biotests de liaison aux récepteurs étaient quant à eux en mesure de détecter les œstrogènes à des concentrations environ dix fois inférieures aux seuils de détection des méthodes d'analyse chimique. Pour le reste, une bonne concordance a été obtenue avec les concentrations mesurées par voie chimique et par voie biologique et avec les résultats des différents essais biologiques.

Risque dû aux cocktails chimiques

Quelles méthodes convient-il donc d'utiliser pour obtenir la meilleure évaluation de la qualité de l'eau ? Pour répondre à cette question, les scientifiques ont tout d'abord évalué le risque pour les populations d'organismes aquatiques (cf. encadré). En se basant sur les analyses chimiques, ils ont comparé les concentrations d'EE2, d'E2 et d'E1 aux NQE correspondantes, ce qui leur a permis de calculer un quotient de risque pour chaque substance. Si la concentration d'un composé individuel est supérieure à sa NQE, le risque d'effets nocifs sur les organismes est jugé inacceptable. Il en va de même pour les effets d'un mélange de substances ayant le même mode d'action : si la somme des quotients de risque individuels de l'EE2, de l'E22 et de l'E1 est supérieure à 1, le mélange présente un risque inacceptable pour la vie aquatique. Cela a été le cas dans 44 % des échantillons d'eau de rivière et 53 % des échantillons d'effluent. À noter, cependant, que seules les concentrations quantifiables ont été prises en compte.

Pour interpréter les résultats des biotests, l'activité des œstrogènes présents dans l'eau est exprimée par la concentration de l'hormone 17β-estradiol qui aurait le même effet que le mélange inconnu. Elle est alors indiquée en équivalents 17β-estradiol (EEQ). Les teneurs en EEQ obtenues avec les biotests sont en bonne concordance avec les quotients de risque cumulés calculés à partir des analyses chimiques. Il apparaît donc que les méthodes basées sur les effets conviennent à une détermination de l'état chimique des eaux ou à l'identification d'échantillons pollués.

Des « triggers » pour l'évaluation du risque écotoxicologique

Pour pouvoir également évaluer le risque environnemental à partir des résultats des biotests, il convient de disposer d'un seuil auquel comparer les concentrations totales en EEQ obtenues pour les substances œstrogéniques. Pour les substances ayant le même mode d'action, des valeurs limites ou « triggers » peuvent être déterminées à partir des données de toxicité disponibles. Ces valeurs ne sont pas encore inscrites dans la loi. Comme pour l'évaluation traditionnelle du risque à partir des analyses chimiques et des NQE, le dépassement d'un « trigger » par la concentration d'équivalents mesurée dans un biotests indique un risque inacceptable pour un mécanisme d'action donné (cf. encadré). Dans l'ensemble, l'évaluation chimique et l'évaluation écotoxicologique du risque ont livré des résultats comparables. Suivant le biotest utilisé, les quotients de risque écotoxicologique variaient légèrement : un risque inacceptable a ainsi été mis en évidence pour 31% - 50 % des échantillons d'eau de rivière et pour 53% - 71 % des échantillons d'effluent. Un tel risque a été identifié dans 11 % d'échantillons de plus que par l'évaluation chimique. Cette différence s'explique en grande partie par le fait que, dans une partie des échantillons, les méthodes d'analyse n'étaient pas assez sensibles pour détecter les hormones EE2 et E2, de sorte que le risque y a été sous-estimé. D'autre part, les biotests ne se limitent pas à la détection des œstrogènes stéroïdes mais mettent également en évidence l'activité d'autres substances chimiques présentant une activité œstrogénique.

Utilisation des tests de liaison aux récepteurs pour les screenings

Les résultats des analyses chimiques n'ont pas pu être utilisés pour déterminer la qualité de l'eau dans 15 % des échantillons d'eau de rivière et 41 % des échantillons d'effluent étant donné qu'au moins une limite de détection était trop élevée. En revanche, les seuils de détection des tests écotoxicologiques étaient inférieurs aux « triggers » proposés pour les cinq méthodes examinées. Les tests de liaison aux récepteurs avec les lignées cellulaires sont donc recommandés en complément des analyses chimiques pour le screening des œstrogènes stéroïdes dans les programmes de surveillance de la qualité des eaux.

Ces tests présentent les avantages suivants : a) ils sont suffisamment sensibles pour quantifier les œstrogènes stéroïdes dans les eaux de surface et les eaux usées, b) ils sont capables de mesurer l'action combinée d'œstrogènes en mélange, qu'ils soient connus ou inconnus, par l'activation du récepteur des œstrogènes et c) ils permettent de déterminer le statut écotoxicologique du milieu à travers des quotients de risque calculés à l'aide de « triggers ». Cette approche ressemble à celle utilisée pour l'évaluation du risque environnemental dans le cadre réglementaire mais elle présente l'avantage supplémentaire d'autoriser une évaluation intégrée des mélanges. Des normes ISO entreront en vigueur dans l'année qui vient pour certains tests de liaison aux récepteurs.

Sur la base de ces résultats, un nouveau projet a été lancé cet automne : plus de 80 échantillons d'eau de surface livrés par 14 États membres de l'UE et 4 cantons suisses y seront soumis à des biotests visant à détecter les œstrogènes et certains médicaments antalgiques (inhibiteurs de la COX). Par ailleurs, le Centre Ecotox coordonne avec le Joint Research Centre de l'UE, la Suède et l'Italie un groupe de travail chargé d'émettre une recommandation pour l'utilisation des biotests dans le cadre de la directive cadre sur l'eau européenne.