24. mai 2018, Catégorie: Ecotoxicologie aquatique

Combiner biotests et chromatographie sur couche mince

En combinant biotests et analyse chimique, il est possible d'identifier les substances toxiques présentes dans les mélanges complexes. La chromatographie sur couche mince permet d'accélérer les analyses et de traiter davantage d'échantillons en moins de temps.

Dans notre environnement, les polluants sont généralement présents sous la forme de mélanges complexes difficiles à analyser substance par substance. Cela s’explique d'une part par le fait que ces mélanges renferment des substances inconnues qui ne peuvent être détectées et identifiées qu'au prix d'un énorme effort analytique et, d'une autre part, nul ne sait exactement lesquelles de ces substances sont réellement toxiques. Dans un tel contexte, le couplage de la chromatographie sur couche mince haute performance (HPTLC), des biotests et de la spectrométrie de masse haute résolution est une solution prometteuse : le Centre Ecotox travaille donc aujourd'hui à l'optimisation de cette méthode avec l'Eawag et la Haute école zurichoise de sciences appliquées (ZHAW) qui la développe depuis 2009. Le projet est financé par l'Office fédéral de la sécurité alimentaire et des affaires vétérinaires (OSAV). 

Le problème des mélanges complexes de composition inconnue

« Il existe encore très peu de méthodes pratiques permettant l'identification des toxiques dans les denrées alimentaires ou les matrices environnementales, indique Alan Bergmann, du Centre Ecotox, qui dirige le projet. Les emballages alimentaires, justement, renferment beaucoup de substances inconnues qui peuvent être émises dans les aliments et dans l'environnement. » Le projet, qui vient à peine de débuter, vise à déterminer la composition d'échantillons réels issus de matériaux d'emballage, d'eau de boisson et d'eau de rivière. Deux effets toxiques majeurs sont visés : tout d'abord, l'œstrogénicité de certaines substances présentes dans les emballages en plastique et dans le milieu aquatique ― ces perturbateurs endocriniens étant tenus pour responsables de graves dysfonctionnements chez l'homme et l'animal se traduisant par un déclin des populations et une perte de fertilité ― et ensuite les effets génotoxiques. 

Le retour de la chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur couche mince connaît aujourd'hui un véritable regain de popularité en raison des améliorations en termes de résolution et de reproductibilité apportées par le développement de l'HPTLC. Dans cette méthode d'une grande simplicité, les échantillons sont disposés sur une plaque de chromatographie et les substances qui les constituent sont séparées par HPTLC en fonction de leur masse et de leur polarité. « Par cette étape, les échantillons complexes sont purifiés de telle sorte qu'aucun traitement supplémentaire n'est nécessaire avant l'analyse », explique Bergmann. Pour la détection des œstrogènes, le test YES a été adapté à une utilisation sur plaque de chromatographie sur couche mince : ce biotest est basé sur des cellules de levure génétiquement modifiées dans lesquelles le récepteur humain des œstrogènes a été couplé à un gène rapporteur ; lorsqu'une substance œstrogénique se lie au récepteur, le gène rapporteur est exprimé et il se forme des β-galactosidases qui transforment un substrat non fluorescent en un composé fluorescent. Après séparation des composés présents dans les échantillons, les plaques de chromatographie sont aspergées de cellules de levure. Au bout de 3 heures, les plaques sont aspergées de substrat et la fluorescence alors obtenue est mesurée. Cette mesure est quantitative. Les bandes bioactives sont éluées de la plaque et les substances qui les constituent identifiées par spectrométrie de masse haute résolution (LC-HRMS/MS). 

Des perspectives encourageantes

« La nouvelle méthode permet de mesurer les œstrogènes en seulement 3-4 heures au lieu de 18 avec la méthode traditionnelle du test YES sur plaques de microtitration, souligne Alan Bergmann. La limite de détection semble également beaucoup plus basse. » De ce fait, l'analyse peut être effectuée aussi bien sur des échantillons non modifiés qu'après extraction et concentration. « Nous avons tout d'abord sélectionné 20 substances dont nous voulons étudier le comportement en détail dans le test ; certaines sont très controversées comme le bisphénol A, le nonylphénol et les phtalates, indique Alan Bergmann. Ensuite, nous nous consacrerons à l'étude des échantillons environnementaux et des extraits d'emballages alimentaires comme par exemple les boîtes de conserve. » Enfin, un test combinant HPTLC et bioessai doit être développé pour mesurer les effets génotoxiques. Le biotest envisagé est le test umuC qui met en œuvre des bactéries génétiquement modifiées qui permettent de rendre visible les réactions de réparation cellulaire. Si cette méthode est à la hauteur des attentes, elle peut être intéressante pour les analyses de routine.

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